|
|
Vliv elučního roztoku na obohacení a přečištění glykopeptidů pomocí SPE-HILIC
Chobotová, Michaela ; Kozlík, Petr (vedoucí práce) ; Křížek, Tomáš (oponent)
Změny v glykosylaci proteinů souvisejí s různými nemocemi jako je rakovina nebo Alzheimerova choroba. Bohužel, analýza glykoproteinů zůstává obtížným úkolem kvůli nízkému podílu glykopeptidů ve srovnání s peptidy získanými po štěpení glykoproteinu. V důsledku toho je téměř nemožné analyzovat glykopeptidy bez specifických kroků obohacení. Vhodnou metodou na obohacení glykopeptidů je extrakce na pevné fázi (SPE) využívající princip hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC). Jelikož výběr rozpouštědla významně ovlivňuje obohacení glykopeptidů, cílem této diplomové práce bylo porovnat vliv různých rozpouštědel na účinnost extrakce glykopeptidů pomocí SPE-HILIC. Extrakce byla prováděna na kolonce s oxidem křemičitým modifikovaným aminopropylovými skupinami. Modelovými analyty byly glykopeptidy získané tryptickým štěpením lisdkého IgG. Při porovnání acetonitrilu, methanolu a isopropanolu byl jako vhodné eluční rozpouštědlo vybrán acetonitril. Při kondicionačním a promývacím kroku byl měněn obsah acetonitrilu (65%, 75% a 85%), přičemž se snižujícím se množstvím acetonitrilu se zrychluje eluce glykopeptidů. V elučním kroku byla zkoumána účinnost různého obsahu acetonitrilu (5%, 10% a 20%), kdy k nejrychlejší eluci docházelo při nejvyšším obsahu acetonitrilu v elučním roztoku. Zkoumání různého...
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy při analýze sacharidové složky glykopeptidů
Šimonová, Alice ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Cílem této diplomové práce byl vývoj metody pro stanovení osmi monosacharidů nejčastěji se vyskytujících v glykoproteinech pomocí kapilární elektroforézy. Konkrétně se jednalo o stanovení glukosy, galaktosy, manosy, N-acetylglukosaminu, N-acetylgalaktosaminu, fukosy, N-acetylneuraminové kyseliny a xylosy. Celková délka křemenné kapiláry s vnitřním průměrem 10 m byla 50,0 cm a efektivní délka 35,0 cm. Základním elektrolytem byla směs hydroxidu sodného o koncentraci 50 mmol/l, hydrogenfosforečnanu sodného o koncentraci 22,5 mmol/l a cetyltrimethylamoniumbromidu o koncentraci 0,2 mmol/l. Vzorky byly dávkovány hydrodynamicky tlakem 5 kPa po dobu 70 s, separace probíhala při napětí -30 kV a tlaku 270 kPa vkládaném na výstupní vialku a detekce analytů probíhala pomocí bezkontaktního vodivostního detektoru. Meze detekce se pohybovaly v rozmezí od 5 do 7 mg/l a meze stanovitelnosti od 16 do 22 mg/l. Opakovatelnost ploch píků a jejich migračních časů vztažených na vnitřní standard kyseliny 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonové poskytla hodnoty relativních směrodatných odchylek menších než 4 %. Nakonec byly určeny vhodné podmínky pro hydrolýzu oligosacharidů na monosacharidy před jejich separací. Hydrolýza probíhala v 4M kyselině chlorovodíkové při 100 řC v blokové lázni, hydrolýza netrvala déle než...
|
|
|
Vznik a genetická podstata glykopeptidové rezistence u koaguláza-negativních stafylokoků
Prášilová, Jana ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Glykopeptidová antibiotika jsou tzv. antibiotika poslední volby, v klinické praxi využívaná k léčbě těžších, převážně nozokomiálních infekcí vyvolaných multirezistentními koaguláza-negativními stafylokoky. Vznik a genetická podstata rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům nebyla u koaguláza-negativních stafylokoků doposud objasněna. Výzkumy prováděné u Staphylococcus aureus prokázaly, že střední rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům je spojena s přítomností jedné či více mutací, spíše než by byla podmíněna nosičstvím konkrétního genetického elementu, jako je tomu u enterokoků. Různými druhy selekce rezistentních mutant in vitro byly získávány izogenní páry glykopeptid citlivých a rezistentních kmenů Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus haemolyticus. Analýzou sekvencí genomů těchto dvojic byly následně identifikovány jedno nukleotidové polymorfismy, které se nacházely převážně v systémech řídících metabolismus a regulaci buněčné stěny. Fenotypová analýza neodhalila přímé spojení glykopeptidové rezistence se zvýšenou tvorbou biofilmu. V klinické praxi je problematický vznik zkřížené rezistence glykopeptidových a jiných antibiotik. U neglykopeptidových antibiotik imipenemu a rifampicinu byl již dříve popsán výskyt zkřížené rezistence s glykopeptidovými antibiotiky u S. aureus. Selekcí...
|
|
|
Vliv exprese vanZTei a vanZg na rezistenci ke glykopeptidovým antibiotikům u Staphylococcus aureus
Zieglerová, Leona ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Membránový protein VanZTei, který je kódován genem vanZ z vanA glykopeptidového rezistenčního genového klastru je součástí velké rodiny VanZ proteinů. VanZTei udílí rezistenci k teikoplaninu u Enterococcus faecalis a to nezávisle na přítomnosti dalších proteinů kódovaných klastrem. Náplní práce bylo porovnat schopnost dvou ortologních proteinů VanZTei a VanZg (z genomické DNA Enterococcus faecium) udílet rezistenci ke glykopeptidům u Staphylococcus aureus RN4220 a u Enterococcus faecium. Bylo zjištěno, že VanZg 8-16 krát zvyšuje rezistenci k teikoplaninu (Tei) a udílí 8 krát větší rezistenci k dalbavancinu (Dalb). VanZTei také udílí rezistenci k Tei i Dalb, ale zvýšení rezistence je jen dvojnásobné. Naopak VanZTei udílí v porovnání s VanZg účinněji rezistenci k nově syntetizovaným glykopeptidovým antibiotikům (čtyřnásobné zvýšení rezistence pro VanZTei a 2-4 násobné zvýšení rezistence pro VanZg). To naznačuje, že oba proteiny mají rozdílnou specificitu k antibiotikům. Přesto byly vyselektovány mutanty S. aureus RN4220 VanZTei pRMC2 se zvýšenou rezistencí k teikoplaninu (MICTei > 8 µg/ml) u nichž je rezistence závislá na expresi vanZTei. Tyto rezistentní mutanty nenesou mutaci v genu vanZTei ani v jeho ribozomálním vazebném místě. Ani jeden z proteinů neudílí rezistenci k vankomycinu a k jiným...
|
|
| |
host ::
RSS.